Inmunohistoquímica

Estaremos postando investigações científicas como auxílio para acadêmicos de Medicina na busca de informação em diferentes assuntos.

Nossos trabalhos estarão, por enquanto, em espanhol. Dentro de dias serão traduzidos ao português.

Introducción
El presente trabajo va describir sobre las técnicas inmunohistoquímicas y como ellas pueden ser aplicadas para detectar antígenos. En las ultimas décadas la utilización de inmunohistoquímica ha sido progresivamente creciente y se ha consolidado como tecnología esencial en el diagnóstico patológico. En general y muy especialmente en patología oncológica, son cada vez más las patologías cuyo diagnóstico y clasificación requiere inmunohistoquímica. La incorporación de nuevos protocolos de recuperación antigénica y la fluencia constante de nuevos anticuerpos están ampliando notablemente el ámbito de aplicación con nuevas utilidades en diagnóstico y pronóstico
El organismo esta en condiciones de reaccionar ante sustancias extrañas o antígenos y formar anticuerpos específicos que se unen con los antígenos. Por lo general actúan como antígenos las macromoléculas proteicas o polisacáridos los anticuerpos son proteínas producidas por las denominadas células plasmáticas y circulan por la linfa y por la sangre. Las células productoras de anticuerpos pertenecen al sistema inmune del organismo, que protege al individuo contra las macromoléculas extrañas que intentan ingresar, por ejemplo, como componentes de bacterias o virus así, los anticuerpos son un eslabón importante en la defensa del organismo contra las enfermedades infecciosas. La reacción entre un antígeno y su anticuerpo es en extremo específica.
Los métodos inmunohistoquímicos se basan sobre la utilización de un anticuerpo específico que se marca mediante un enlace químico en una sustancia que se pueden transformar en visible; sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo con el antígeno.

Desarrollo

Definición

Corresponde a un grupo de técnicas de inmunotinción que permiten demostrar una variedad de antígenos presentes en las células o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas técnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse específicamente a los correspondientes antígenos. Esta reacción es visible sólo si el anticuerpo esta marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloración.

Métodos

Técnica de Inmunofluorescencia
Se utilizan como marcadores compuestos de fluoresceína que bajo luz ultravioleta emiten luz de longitud de onda visible, que depende de la naturaleza del compuesto. El isotiocianato de fluoresceína emite luz verde amarillenta intensa. Estas técnicas necesitan muestras en fresco y congeladas, sin fijación convencional, pues los antígenos están presentes en superficies celulares o son muy lábiles a la fijación en formalina. La inmunofluorescencia directa, es decir con anticuerpos conjugados con fluoresceína, se aplica corrientemente en el diagnóstico de las enfermedades cutáneas en donde tiene indicación y utilidad muy precisas como en enfermedades ampollares, vasculitis y mesenquimopatías. Esta técnica pese a ser muy sensible, presenta inconvenientes como la falta de permanencia de la fluorescencia, requiere de microscopía especializada y el detalle morfológico es pobre. Para documentar cada caso, es necesario fotografiar la reacción.

Técnicas de Inmunoperoxidasase
Se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas más frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo) y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamene al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o proteína A.
El espectro de anticuerpos disponibles comercialmente crece día a día y actualmente es posible encontrar marcadores para una amplia gama de antígenos.

Técnicas Inmunohistoquímicas Enzimáticas
Permite una localización más precisa de las reacciones, ya que la tinción es permanente, estable, puede contrastarse y puede ser evaluada con microscopio de luz. El material así estudiado puede archivarse por años sin pérdida de la intensidad de la reacción. Los anticuerpos monoclonales han permitido aumentar la especificidad, sensibilidad y gama de esta técnica. Desventajas existen: presencia de reacción inespecífica, especialmente cuando se utilizan anticuerpos policlonales, algunos reactivos son potencialmente carcinógenos y su manipulación debe ser cuidadosa, requieren estandarización precisa y estricto control de calidad. Existen diversos tipos de técnicas, cuya indicación dependerá del anticuerpo a utilizar (monoclonal o policlonal), material disponible (fresco, congelado o fijado en formalina) y antígenos a estudiar (de superficie o membrana, citoplasmáticos o nucleares).
Estas técnicas necesitan de controles internos o paralelos, usualmente positivos y negativos. El control negativo se obtiene realizando la misma técnica, pero con omisión del paso de incubación con anticuerpo primario. Existen sistemas automatizados que permiten la tinción de un gran número de casos simultáneamente con la ventaja de pasos definidos y estandarización de la variable usuales con costo relativamente bajo y en mucho menor tiempo.

Técnicas Utilizadas en Diagnósticos Tumorales
La inmunohistoquímica tiene utilidad diagnóstica en identificación de diferenciación y de marcadores pronósticos de neoplasias (marcadores tumorales). Por ejemplo, es posible la identificación de los productos de oncogenes y de genes supresores de tumores con anticuerpos monoclonales, especialmente contra c-erbB-2, bcl-2, p21, Rb1 y p53; la identificación de marcadores de diferenciación como HMB-45 para melanocitos (melanoma), AE1 para carcinomas, vimentina para sarcomas y CD45 para leucocitos (linfomas).
Un elemento importante a considerar es la óptima preservación del tejido y por ende de los antígenos. La mayoría de los antígenos se conservan adecuadamente después de la fijación en formalina (formol neutro con un pH=7 o con alcohol 98%) e inclusión en parafina. Algunos son más hábiles y sólo se detectan en cortes de congelación.
Uno de los problemas actuales con estas técnicas no es la técnica en sí, manual o automatizada, o la posibilidad de acceder a los numerosos anticuerpos existentes, sino la interpretación de los resultados. Los errores de interpretación disminuyen a nivel aceptable cuando el patólogo y sus colaboradores tienen experiencia en estas técnicas y los resultados se analizan a la luz de los demás hallazgos clínico-patológicos.

Biología molecular aplicada a histopatología
Este conjunto de técnicas, que han sido tomadas tanto de la genética molecular como de la bioquímica, nos permite analizar fenómenos biológicos y patológicos en el nivel molecular. Al igual que la microscopía electrónica y la inmunohistoquímica, estas técnicas pueden aplicarse para refinar el diagnóstico en Anatomía Patológica.
Pueden enumerarse las siguientes técnicas: hibridación in situ, reacción en cadena de polimerasa (PCR), in situ-PCR , análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción, Southern blot, Western blot y Northern blot. Todas las técnicas mencionadas pueden aplicarse al material obtenido por biopsia, autopsia e incluso muestras citológicas.
La técnica de Southern blot permite el análisis de ADN genómico o fragmentos definidos de ADN después de digestión con endonucleasas de restricción. La técnica de Northern blot permite estudiar ARN en forma análoga. El Western blot es una técnica inmunológica derivada , que se utiliza para analizar antígenos proteicos. Las proteínas se separan mediante electroforesis y se transfieren a una membrana sólida o membrana o filtro. La membrana se incuba con anticuerpos, los que se detectan ulteriormente con sondas marcadas radioactivamente o con enzimas.

Cáncer de presentación metastásica
Las formas de presentación y los síntomas que aparecen en el debut de la enfermedad pueden ser enormemente variados entre sí y dependen fundamentalmente del estado general del paciente, la localización del tumor primario y la distribución de las metástasis.
Estos pacientes acuden por una sintomatología directamente relacionada con las metástasis y un número importante de cuestiones por resolver, fundamentalmente en lo referente a la localización del tumor primario, la extensión real de la enfermedad, la histología, el pronóstico y las posibilidades de tratamiento.
Por otro lado, la entidad conocida como cáncer metastásico de origen desconocido (CMOD), representa una situación diferente. Son pacientes que debutan como un cáncer de presentación metastásica y que posteriormente han sido sometidos a un proceso diagnóstico más exhaustivo e infructuoso para la identificación del tumor primario.
Tanto el cáncer de presentación metastásica como el CMOD, constituyen un grupo heterogéneo de neoplasias y característicamente son tumores cuyo origen y frecuencia suelen ser diferentes a lo habitual. Predominan los tumores primarios de pulmón y de páncreas, mientras que otros, con una incidencia importante en la población, como el cáncer colorrectal, mama o próstata, se presentan con una frecuencia mucho menor.

Estudio diagnóstico en el cáncer de presentación metastásica
En los últimos años, se ha tratado de definir con mayor claridad cual debe ser el estudio diagnóstico básico antes de considerar un paciente como CMOD. El National Cancer Institute de Norteamérica, la National Comprehensive Cancer Network y la European Society Medical Oncology han publicado recientemente las recomendaciones mínimas sobre esta materia.
El estudio básico que plantean establece como requisito indispensable la evaluación histológica de las metástasis, que permite por un lado una aproximación diagnóstica hacia ciertos tumores concretos como linfomas, melanomas, sarcomas, tiroides o tumores germinales.
Junto al estudio diagnóstico anatomopatológico, es necesaria la realización de un conjunto de exploraciones complementarias consideradas básicas. Estas exploraciones son la exploración física completa, la analítica de sangre y orina convencionales, un test de sangre oculta en heces y una radiografía de tórax, además de la determinación sérica de la aFP y la bhCG en los varones para descartar tumores de células germinales extragonadales potencialmente curables, y el PSA en todos los pacientes mayores de 40 años.
La realización de una TAC abdómino-pélvica, y una mamografía en mujeres, son igualmente necesarias. Estas exploraciones pueden ayudar a identificar algunos tumores primarios como el cáncer de ovario o el de mama, candidatos a un tratamiento específico y claramente beneficioso incluso en un estadio avanzado de la enfermedad.
En definitiva, el criterio para definir qué exploraciones son recomendables en primer lugar, y por tanto ligadas a la propia definición de CMOD, debe ser cuando se considera que con ellas se han descartado todos aquellos tumores primarios con posibilidades de tratamiento específico y eficaz. En este sentido, la exhaustividad y el número de exploraciones podrán ir cambiando en función de los avances en materia de diagnóstico y tratamiento.
A partir de aquí, y una vez identificado el paciente como afecto de un CMOD, no parece apropiado seguir realizando baterías amplias de exploraciones complementarias con el objeto de conseguir por todos los medios la identificación del tumor primario.

Diagnóstico anatomopatológico
El patólogo tiene un papel fundamental en la evaluación de un cáncer de presentación metastásica, y este papel es todavía mucho mayor, cuando tras un estudio clínico básico, no existe evidencia de tumor primario.
El material anatomopatológico debe ser de la máxima calidad, extremando las condiciones de obtención y conservación. Debe primarse la biopsia quirúrgica sobre otras técnicas (tru-cut biopsia, punción citológica, etc) con el fin de disponer de material lo más abundante posible, en previsión de otras técnicas o tinciones histopatológicas.

*Anatomía Patológica Básica: el primer paso consiste en realizar un examen histológico basado en las técnicas tincionales convencionales tipo hematoxilina-eosina (y otras tinciones clásicas para mucopolisacáridos, azul-alcian, mucicarmín y pas-diastasa), que permita agrupar los diagnósticos anatomopatológicos en "específicos" e "inespecíficos", según su grado de proximidad a un diagnóstico concreto.
La mayoría de los diagnósticos pertenecen a la categoría de "inespecíficos", y son fundamentalmente adenocarcinomas o tumores indiferenciados. Entre los diagnósticos "específicos" figuran el tumor primario de cualquier localización y otros diagnósticos claramente definidos como los linfomas, sarcomas, melanomas, etc.

*Anatomía Patológica Especial: en el grupo de diagnósticos inespecíficos es donde se recomienda un estudio adicional mediante la aplicación de técnicas histopatológicas más sofisticadas como la inmunohistoquímica, la microscopía electrónica o la genética molecular. La indicación de estas técnicas debe establecerse de manera individualizada, y permite orientar o confirmar, con el consiguiente ahorro de tiempo y exploraciones complementarias, el diagnóstico de un tumor primario concreto.
**Inmunohistoquímica: reconoce los filamentos intermedios y otros péptidos estructurales o producidos a gran escala por las células neoplásicas. De esta forma, permite relacionar determinados marcadores celulares con diferentes estirpes tumorales, y que en algunos casos son suficientes para establecer un diagnóstico.
En el caso de utilizar esta técnica, se recomienda un panel inmunohistoquímico básico que ayude a diferenciar las grandes estirpes celulares como tumores epiteliales, mesenquimales o linfoides, y posteriormente efectuar estudios dirigidos a precisar mejor un diagnóstico, fundamentalmente en carcinomas epiteliales y neoplasias indiferenciadas, mediante la utilización de paneles más específicos.
El adenocarcinoma mal diferenciado requiere una consideración aparte. El diagnóstico diferencial se hace extensísimo ante la presencia ocasional de estructuras de aspecto glandular o papilar, citoplasmas vacuolados o la secreción celular aislada de mucopolisacáridos. En estos casos es aconsejable ampliar el panel inmunohistoquímico hasta diferenciar específicamente los adenocarcinomas con mayores posibilidades de tratamiento, fundamentalmente los adenocarcinomas de mama, ovario, próstata y tiroides.
Durante los últimos años han surgido algunos intentos de confeccionar paneles de anticuerpos que faciliten una primera orientación ante un paciente con CMOD. DeYoung publicó los resultados de un estudio interesante basado en el valor predictivo de 14 marcadores inmunohistoquímicos para la detección del tumor primario subyacente. El algoritmo propuesto obtenía una tasa de fiabilidad en la detección del tumor primario del 67%, confirmándose estos mismos resultados con otras baterías similares de marcadores inmunohistoquímicos, como las realizadas por Brown y Gamble algunos años antes.
Todos ellos recomiendan como punto de partida una inmunotinción con una mezcla de anticuerpos monoclonales contra diversas citoqueratinas, que incluyen AE1/AE3, CAM 5.2, MAK-6, Ker-20 y CK20, y como consecuencia de la elevada sensibilidad demostrada por la mayoría de tumores primarios, dirigir el resto de marcadores inmunohistoquímicos a partir de aquí.

Tratamiento y planteamiento general
El tratamiento de estos pacientes, en los cuales se diagnostica el tumor primario, es ordinariamente el equivalente al de esos mismos tumores en estadios avanzados de la enfermedad. Entre estos tumores se hallan algunos con una sensibilidad alta al tratamiento sistémico, y unas tasas elevadas de supervivencia e incluso curaciones.
En conjunto, al menos un 25% de pacientes diagnosticados de CMOD pueden disponer de tratamiento específico y esta cifra podría ser muy superior si consideramos el cáncer de presentación metastásica en su totalidad.
Aunque sólo una minoría de pacientes tendrá un tumor curable o una enfermedad para la cual exista un tratamiento que represente un beneficio substancial, no se debe perder la oportunidad de identificar a estos pacientes a pesar de que el primario permanezca oculto.
En el resto de pacientes en los que no se haya identificado la neoplasia primaria, y que tampoco presenten un diagnóstico anatomopatológico específico, puede estar indicado un tratamiento de quimioterapia de "amplio espectro" con el fin de inducir una respuesta del tumor y con ello mejorar la supervivencia.
Hasta el momento, no existe una pauta consolidada de tratamiento. Los estudios en CMOD en pacientes con histología de adenocarcinoma, e incluso de carcinomas indiferenciados publicados hasta mediados de los años 90 y utilizando citostáticos clásicos como 5-fluorouracilo, antraciclinas o alquilantes, ofrecían unos resultados desesperanzadores. En este tipo de pacientes, las combinaciones con derivados del platino fueron las que presentaron las mejores tasas de respuesta (20-30%), pero a la larga sin una repercusión en la supervivencia, que seguía siendo inferior a los 6 meses.

Artículo – “IX Congreso Virtual Hispanoamericano de Anatomía Patológica y II Congreso de Preparaciones Virtuales por Internet”.
→Asociaciones entre características patológicas y marcadores inmunohistoquímicos en subtipos de cáncer de mama ductal infiltrante
Cristina Bértolo Martín de Rosales, David Guerrero Setas, Alicia Córdoba Iturriagagoitia, Francisco Vicente García, Mercedes Murillo Lalana, María Cristina Caballero Martínez, José María Martínez-Peñuela Virseda, José Miguel Lera Tricas(1) Centro de Investigación Biomédica, Servicio Navarro de Salud, Pamplona, Navarra. ESPAÑA(2) Servicio de Anatomía Patológica, Hospital de Navarra, Servicio Navarro de Salud, Pamplona, Navarra. ESPAÑA(3) Servicio de Cirugía General y Digestiva, Hospital de Navarra, Servicio Navarro de Salud, Pamplona, Navarra. ESPAÑA
ESTADO ACTUAL DEL TEMA: El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea que incluye los subtipos luminal, basal, Her2 y normal, que difieren desde el punto de vista clínico. Hemos planteado analizar las posibles asociaciones entre el marcaje de las proteínas p53, bcl-2 y ki-67 implicadas en la progresión celular en cáncer de mama, y las características anatomopatológicas de los tumores. Asimismo pretendemos realizar una evaluación de este marcaje en los distintos subtipos de cáncer de mama.
PACIENTES Y MÉTODOS: Hemos clasificado las pacientes con cáncer de mama en los cuatro subtipos mediante el estudio de los marcadores c-erbB-2, EGFR, cytokeratin 5/6 and p63. Se ha estudiado mediante inmunohistoquímica la expresión de las proteínas p53, bcl-2 y ki-67 en 60 pacientes con cáncer de mama ductal infiltrante (CDI). RESULTADOS: Los subtipos encontrados son el subtipo luminal (36.6% de los casos), basal (16%), HER2 (45%) y normal (1.6%). La proteína bcl-2 se expresa preferentemente en los tumores luminales (p=0.003). Este resultado contrasta claramente con los obtenidos en el subtipo basal caracterizados por la baja o ausente expresión de dicha proteína bcl-2 (P=0.034). Los tumores basales presentan un grado histológico alto (p=0.003) y un estado de proliferación intermedio o alto (p=0.049). No hay diferencias en la expresión del resto de proteínas estudiadas.
CONCLUSIÓN: La expresión de varias proteínas difiere entre los distintos subtipos de cáncer de mama y pueden ser usados como marcadores para identificar estos subtipos.

Anexos
Anexo 1

Conclusión
Con el siguiente trabajo comprendemos la importancia de las técnicas inmunohistoquímicas, que permiten la identificación, sobre muestras tisulares o citológicas, de determinantes antigénicos característicos de distintas líneas de diferenciación y funcionalismo celular. La aplicación directa de anticuerpos policlonales o monoclonales sobre secciones tisulares permite la localización microanatómica de su expresión y su correlación con los parámetros morfológicos, aumentando la sensibilidad y especificidad del estudio y proporcionando información adicional esencial en muchos casos.
Son técnicas utilizadas en casos raros, cuando el patólogo no consigue identificar, por artificios histológicos comunes, el origen de las células antigénicas. Son usados marcadores inmunohistoquímicos específicos, donde cada anticuerpo va reaccionar con su debido antígeno. Al igual que la microscopía electrónica, la inmunohistoquímica posee técnicas que pueden aplicarse para refinar el diagnóstico en anatomía patológica.
Es una técnica a la cual requiere una metodología de laboratorio muy distinta de la del laboratorio clásico de anatomía patológica y, para su correcta utilización, es indispensable conocer en profundidad sus ventajas y limitaciones. Además de la inmunohistoquímica ser sofisticada exige un alto costo, por eso no es frecuentemente utilizada. El panel inicial de estudio debe elaborarlo el patólogo en función de la clínica, y del estudio morfológico previo y, siempre que sea posible, debe incluir distintos anticuerpos para cada una de las líneas de diferenciación que se investigan.
Por lo tanto, los métodos inmunohistoquímicos son necesarios para el avance de los estudios de la medicina patológica y muy importantes para el diagnostico de enfermedades raras, que se desconocen su etiología, como en el cáncer.

Bibliografía
1.- http://escuela.med.puc.cl/publ/patologiageneral/Patol_125.html;

2.- http://es.wikipedia.org/wiki/Inmunohistoqu%C3%Admica;

3.- Artículo: http://www.conganat.org/9congreso/trabajo.asp?id_trabajo=872&tipo=2;

4.-http://www2.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0535-51332004000300003&1ng=es&nrm=isso;

5.- http://www.merck.de/servlet/PB/menu/1401820/index.html;

6.- Finn Geneser. Histología. 3ª edición. Año 2000;

7.- Consulta con el Dr. Graciani, Profesor de Anatomía Patológica Macro y Microscópica de la Facultad H. A. Barceló, Ctes-Argentina.